NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）酯和其他活化酯（磺基-NHS、磺基四氟苯基 - STP）是适合氨基修饰的反应性化合物。 NHS 是最常见的活化酯类型。

常见的修饰是荧光标记、荧光猝灭剂和其他报告基团。可以使用活化酯连接炔烃和叠氮基，以使生物分子适应点击化学。

尤其常见的是蛋白质和肽的修饰，因为它们几乎总是含有氨基。其他例子是氨基寡核苷酸的修饰、氨基修饰的DNA和含氨基的糖。

NHS 酯与氨基的反应强烈依赖于 pH 值：在低 pH 值下，氨基被质子化，并且不会发生修饰。在高于最佳 pH 值时，NHS 酯的水解速度很快，并且修饰分子的产率会降低。改性的最佳pH值为8.3-8.5。

水是用于溶解 NHS 酯以进行生物分子标记的常用溶剂。如果NHS酯难溶于水溶液，可首先将其溶解在二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中，然后添加到pH 8.3-8.5缓冲液中的蛋白质溶液中。请注意，DMF 可以降解为二甲胺，二甲胺具有鱼腥味，并且能够与活化酯发生反应。因此，标记生物分子时，使用不含二甲胺、无鱼腥味的高质量DMF非常重要。

我们建议使用以下通用方案用Lumprobe 生产的NHS 酯标记生物分子：

1. 使用下面的公式或我们的蛋白质标记计算器计算所需的 NHS 酯量：

   NHS_酯_重量 [mg] = 8 × 氨基_化合物_重量 [mg] × NHS_酯_摩尔_重量 [Da] / 氨基_化合物_摩尔_重量 [Da]。

   8是摩尔过量的NHS酯。它是单标记的经验值，适用于许多常见的蛋白质和肽。然而，在某些情况下，使用更少或更多的 NHS 酯可以增加修饰生物分子的产量。它取决于蛋白质结构、标记所用试剂及其溶解度。 Lumiprobe 产品的摩尔重量可以在相应的产品页面上找到。

   例如，要使用 Cy5 NHS 酯（摩尔量 616 道尔顿）标记 3 mg BSA（摩尔量 66500 道尔顿），并获得单标记产物的最大产量，应使用 8 × 3 mg × 616 Da / 66500 Da = 0.22 毫克 Cy5 染料 NHS 酯。

2. 计算反应混合物的体积。标记反应中的最佳生物分子浓度为1-10 mg/mL。标记可以在任何规模上进行，从纳摩尔到几十克。如果标记少量生物分子，请将反应混合物的体积保持在低水平 (10-20 uL)。

3. 将 NHS 酯溶解在 1/10 反应体积的水、DMF 或 DMSO 中。不含二甲胺的DMF或水是优选的溶剂。溶解在 DMF 中的 NHS 酯可在 -20°C 下在溶液中保存 1-2 个月。 NHS酯的水溶液配制后应立即使用。

4. 将生物分子溶解在 9/10 反应体积的 pH 8.3-8.5 缓冲液中。

   0.1 M 碳酸氢钠溶液具有适当的 pH 值。另一种选择是 0.1 M 磷酸盐缓冲液。请注意，pH 值是成功用 NHS 酯标记生物分子的最重要因素。避免使用含有胺的缓冲液（有时可以使用基于 Tris 的缓冲液，但不推荐使用。Tris 含有氨基，但对活化酯的亲和力较低）。

   在进行大规模标记（使用数百毫克 NHS 酯）时，请注意，由于 NHS 酯的水解，混合物会随着时间的推移而酸化。监测 pH 值，或使用浓度更高的缓冲液。

5. 将 NHS 酯溶液添加到生物分子溶液中，并充分涡旋。在冰上放置过夜，或在室温下放置 1 至 4 小时。

6. 使用适当的方法纯化缀合物：大分子凝胶过滤是最常见的。色谱法是另一种选择。对于蛋白质和核酸，可以使用乙醇或丙酮沉淀。有机杂质（如 N-羟基琥珀酰亚胺、NHS 酯和水解产生的酸）几乎总是可以通过这些方法轻松分离。

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